GB 4789.12-2025 食品安全国家标准 食品微生物学检验 产肉毒毒素梭菌及肉毒毒素检验

　　中华人民共和国国家标准

　　GB4789.12—2025

　　食品安全国家标准

　　食品微生物学检验

　　产肉毒毒素梭菌及肉毒毒素检验

　　2025-09-02发布2026-03-02实施

　　中华人民共和国国家卫生健康委员会

　　国家市场监督管理总局发布

　　前 言

　　本标准代替GB4789.12—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检

　　验》。

　　本标准与GB4789.12—2016相比,主要变化如下:

　　———增加了术语和定义;

　　———增加了梭菌实时荧光PCR鉴定方法;

　　———修改了标准名称;

　　———修改了范围;

　　———修改了设备和材料、培养基和试剂;

　　———修改了检验程序、操作步骤、结果与报告及附录。

　　1 范围

　　本标准规定了食品中产肉毒毒素梭菌及肉毒毒素(botulinumneurotoxin)的检验方法。

　　本标准适用于食品中产肉毒毒素梭菌及肉毒毒素的检验。

　　2 术语和定义

　　产肉毒毒素梭菌

　　革兰氏阳性厌氧杆菌,能形成卵圆形芽孢,一般芽孢会大于菌体、位于次端,在适宜培养条件下能产

　　生肉毒毒素的一类细菌的统称。包含肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum )、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum

　　)等。

　　3 设备和材料

　　除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。

　　3.1 冰箱:2℃~8℃、-18℃~-20℃、-80℃。

　　3.2 天平:感量0.1g、0.001g。

　　3.3 pH 计、pH 比色管或精密pH 试纸。

　　3.4 无菌剪刀、镊子、试剂勺。

　　3.5 均质器或无菌乳钵。

　　3.6 离心机:3000g 、14000g。

　　3.7 厌氧培养装置:厌氧培养箱、厌氧罐、厌氧袋或提供同等厌氧效果的装置。

　　3.8 恒温培养箱:36℃±1℃、28℃±1℃。

　　3.9 恒温装置:36℃±1℃、60℃±1℃、80℃±1℃、100℃±1℃。

　　3.10 显微镜:100×~1000×。

　　3.11 普通PCR仪和实时荧光PCR仪。

　　3.12 普通电泳仪或毛细管电泳仪。

　　3.13 凝胶成像系统或紫外检测仪。

　　3.14 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

　　3.15 微量移液器及配套灭菌吸头:2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。

　　3.16 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)、25mL(具0.1mL刻度)。

　　3.17 无菌锥形瓶:100mL。

　　3.18 培养皿:直径90mm。

　　3.19 离心管:1.5mL、5mL、50mL 。

　　3.20 无菌滤器:滤膜孔径0.45μm、0.22μm。

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　　3.21 PCR反应管。

　　3.22 无菌注射器:1mL。

　　3.23 小鼠:体重15g~20g,每一批次试验应使用同一品系单一性别的KM(昆明)或ICR小鼠,同性别

　　小鼠个体间体重相差不超过平均体重的±20%,且如是雌性动物应未交配、未妊娠。

　　4 培养基和试剂

　　除另有规定外,PCR 试验所用试剂为分析纯或符合生化试剂标准,培养基制备用水应符合

　　GB4789.28中的要求。

　　4.1 生理盐水:见A.1。

　　4.2 庖肉培养基:见A.2。

　　4.3 胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤(TPGYT)培养基:见A.3。

　　4.4 卵黄琼脂培养基:见A.4。

　　4.5 哥伦比亚血琼脂培养基:见A.5。

　　4.6 明胶磷酸盐缓冲液:见A.6。

　　4.7 磷酸盐缓冲液(PBS):见A.7。

　　4.8 革兰氏染色液:见A.8。

　　4.9 胰蛋白酶:活力为1∶250或0.25%。

　　4.10 肉毒毒素诊断血清:混合型、A 型、B型、E型、F型。

　　4.11 1mol/L氢氧化钠。

　　4.12 1mol/L盐酸。

　　4.13 无水乙醇和95%乙醇。

　　4.14 10mg/mL溶菌酶溶液。

　　4.15 10mg/mL蛋白酶K溶液。

　　4.16 3mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)。

　　4.17 TE缓冲液。

　　4.18 引物和探针:临用时用灭菌超纯水或TE缓冲液配制成浓度为10μmol/L。

　　4.19 10×PCR缓冲液:0.5mmol/LKCl、0.1mmol/LTris-HCl(pH8.3)、0.015mmol/L MgCl2。

　　4.20 25mmol/L MgCl2。

　　4.21 dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP浓度均为10mmol/L。

　　4.22 Taq DNA 聚合酶:5U/μL。

　　4.23 琼脂糖:电泳级。

　　4.24 溴化乙锭、Goldview或其他核酸染料。

　　4.25 5×TBE或10×TAE缓冲液。

　　4.26 6×加样缓冲液。

　　4.27 DNA 分子质量标准:涵盖目标条带长度。

　　5 检验程序

　　产肉毒毒素梭菌及肉毒毒素检验程序见图1。

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　　注:报告(一):样品中未检出或检出(某型别)肉毒毒素;报告(二):样品中未检出或检出产(某型别)肉毒毒素梭菌;

　　报告(三):样品中未检出或检出产(某型别)肉毒毒素的某种梭菌。

　　图1 产肉毒毒素梭菌及肉毒毒素检验程序

　　6 操作步骤

　　6.1 样品制备

　　固态、半固态及难吸取的液态食品,以无菌操作称取25g,放入无菌均质袋或无菌乳钵,块状食品以

　　无菌操作切碎。含水量较高的食品加入25mL明胶磷酸盐缓冲液,乳粉、牛肉干等含水量低的食品加

　　入50mL(或更多,稀释液体积可根据样品水分含量酌情增减,一般稀释至可接种即可)明胶磷酸盐缓冲

　　液,浸泡30min,用拍击式均质器拍打1min~2min或用无菌研杵研磨制备样品匀液,收集备用。

　　易吸取的液态食品摇匀后取25mL备用。

　　注:取样后的剩余样品放2℃~8℃冷藏保存,直至检验报告发出后,检出阳性的样品采用压力蒸汽灭菌方式进行

　　无害化处理,建议121℃高压蒸汽灭菌30min以上。

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　　6.2 肉毒毒素检验

　　6.2.1 毒素液制备

　　取6.1中制备的样品匀液约30 mL 或均匀液体样品25 mL 放入无菌离心管中,3000g 离心

　　10min~20min,收集上清液分为两份放入无菌试管中,一份直接用于毒素检测,另一份按6.2.2用胰蛋

　　白酶处理后进行毒素检测。

　　6.2.2 胰蛋白酶处理上清液的制备

　　用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节上清液pH 至6.2±0.2,按9份上清液加1份胰蛋白酶

　　(活力1∶250)溶液,混匀,36℃±1℃孵育1h,期间间或轻轻摇动反应液。

　　6.2.3 毒素检出

　　用1 mL 注射器分别取离心上清液和胰蛋白酶处理上清液分别腹腔注射小鼠各3 只,每只

　　0.5mL,观察和记录小鼠48h内的中毒表现。典型肉毒毒素中毒症状通常在24h内出现,多数在6h

　　内发病和死亡,其主要表现为竖毛,四肢瘫软,呼吸困难、呈现风箱式呼吸,腰腹部凹陷、宛如蜂腰,多因

　　呼吸衰竭而死亡,可初步判定为肉毒毒素所致。若小鼠在24h后发病或死亡,应仔细观察小鼠症状,必

　　要时采用低温蒸发等方法浓缩上清液重复试验,以确认肉毒毒素中毒。若小鼠出现猝死(注射后

　　30min内)导致肉毒毒素中毒症状不明显时,应用明胶磷酸盐缓冲液对毒素上清液进行适当稀释,重复

　　试验。

　　6.2.4 毒素确证

　　上清液或(和)胰蛋白酶处理上清液的毒素试验阳性者,取相应阳性试验液3份,每份0.5mL,其中

　　第一份加等量混合型肉毒毒素诊断血清,混匀,36℃±1℃孵育30min~45min;第二份加等量明胶磷

　　酸盐缓冲液,混匀后煮沸10min;第三份加等量明胶磷酸盐缓冲液,混匀。将3份混合液分别腹腔注射

　　小鼠各2只,每只0.5mL,观察96h内小鼠的中毒和死亡情况。

　　若注射第一份和第二份混合液的小鼠未死亡,而第三份混合液小鼠发病死亡,并出现肉毒毒素中毒

　　的典型症状,则判定检测样品中检出肉毒毒素。

　　6.2.5 毒力测定(如需开展,可按以下条款执行)

　　取6.2.4中确证阳性的上清液,用明胶磷酸盐缓冲液制备一定稀释倍数的稀释液,如10倍、50倍、

　　100倍、500倍等,分别腹腔注射小鼠各2只,每只0.5mL,观察96h内小鼠的中毒和死亡情况,计算最

　　低致死剂量(minimumlethaldose,MLD),以MLD/mL 或MLD/g表示,评估样品中肉毒毒素毒力,

　　MLD等于小鼠全部死亡的最高稀释倍数乘以样品稀释倍数。例如,样品稀释两倍制备的上清液,再稀

　　释100 倍组的小鼠全部死亡,而500 倍稀释液组的存活,则该样品毒力为200 MLD/g 或

　　200MLD/mL。

　　6.2.6 毒素定型(如需开展,可按以下条款执行)

　　根据毒力测定结果,用明胶磷酸盐缓冲液将上清液稀释至10MLD/mL~1000MLD/mL用于定

　　型试验,分别与各单型肉毒毒素诊断血清等量混合(国产诊断血清一般为冻干血清,用1mL生理盐水

　　溶解),36℃±1℃孵育30min~45min,分别腹腔注射小鼠2只,每只0.5mL,观察96h内小鼠的中

　　毒和死亡情况。同时,用明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清,与上清液等量混合作为小鼠试验对照。当某

　　一单型诊断血清组动物未发病且正常存活,而对照组和其他单型诊断血清组动物发病死亡,则判定样品

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　　GB4789.12—2025

　　中所含肉毒毒素为该型肉毒毒素。

　　注:未经胰蛋白酶激活处理的样品上清液的毒素检出或确证试验为阳性者,则毒力测定和定型试验可省略胰蛋白

　　酶处理试验。

　　6.3 产肉毒毒素梭菌检验

　　6.3.1 增菌培养

　　6.3.1.1 取庖肉培养基4支和TPGY 培养基2支,隔水煮沸15min,排除溶解氧,迅速冷却,切勿摇

　　动,在TPGY培养基中缓慢加入胰蛋白酶溶液至液面下肉汤中,每支1mL,制备成TPGYT培养基。

　　6.3.1.2 吸取6.1制备的样品匀液接种至庖肉培养基和TPGYT培养基,每管接种2mL。每份样品接

　　种4支庖肉培养基,其中2 支直接放置36 ℃ ±1 ℃ 厌氧培养5d,另2 支放置80 ℃ ±1 ℃ 保温

　　10min,再放置36℃±1℃厌氧培养5d;接种2支TPGYT培养基,28℃±1℃厌氧培养5d。

　　注:接种时,用无菌吸管轻轻吸取样品匀液或离心沉淀悬浮液,将吸管口小心插入肉汤管底部,缓缓放出样液至肉

　　汤中,切勿搅动或吹气。

　　6.3.1.3 检查记录增菌培养物的浊度、产气、肉渣颗粒消化情况,并注意气味。部分产肉毒毒素梭菌培

　　养物为肉汤混浊、产气、消化肉粒、有异臭味。

　　6.3.1.4 取增菌培养物进行革兰氏染色镜检,观察菌体形态,注意是否有芽孢、芽孢的相对比例、芽孢在

　　细胞内的位置。

　　6.3.1.5 若增菌培养物5d无菌生长,应延长培养至10d,观察生长情况。

　　6.3.1.6 取有菌生长且有芽孢的阳性管上清液,按6.2的方法进行毒素检出和确证试验,必要时进行毒

　　素定型试验,阳性结果可证明样品中有产肉毒毒素梭菌存在。

　　6.3.2 分离与纯化培养

　　6.3.2.1 吸取1mL有菌生长且有芽孢的阳性管增菌液至无菌管中,加入1mL无水乙醇,混匀,在室温

　　下放置1h。

　　6.3.2.2 取经乙醇处理的增菌液分别划线接种至卵黄琼脂平板和哥伦比亚血琼脂平板,36℃±1 ℃厌

　　氧培养24h~48h。

　　6.3.2.3 观察平板培养基上菌落形态。在卵黄琼脂平板上,产肉毒毒素梭菌菌落呈隆起或扁平、光滑或

　　粗糙,易蔓延生长,边缘不规则,在菌落周围形成乳色沉淀晕圈,在斜射光下观察,菌落表面呈现珍珠样

　　虹彩,这种光泽区可随蔓延生长扩散到不规则边缘区外的晕圈,部分型别菌株周围形成的乳色沉淀晕

　　圈、珍珠样虹彩光泽不明显。在哥伦比亚血琼脂平板上,产肉毒毒素梭菌呈圆形、半透明扁平菌落,边缘

　　整齐或不整齐,易蔓延生长,部分型别菌株也可形成白色隆起、不蔓延生长菌落。

　　6.3.2.4 在分离培养平板上选择5个梭菌可疑菌落(少于5个时则全选),划线接种卵黄琼脂平板或哥

　　伦比亚血琼脂平板,36℃±1℃厌氧培养24h~48h,按6.3.2.3观察菌落形态及其纯度。

　　6.3.3 鉴定试验

　　6.3.3.1 染色镜检

　　挑取可疑单个菌落进行涂片、革兰氏染色和镜检。产肉毒毒素梭菌菌体形态为革兰氏阳性杆菌、芽

　　孢卵圆形、一般芽孢会大于菌体且位于次端,菌体呈网球拍状。

　　6.3.3.2 毒素编码基因检测

　　挑取6.3.3.1中典型菌落进行毒素编码基因检测。

　　a) 菌株培养:挑取可疑菌落或待鉴定菌株接种TPGY培养基,28℃±1℃厌氧培养20h~24h。

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　　b) DNA 模板制备:吸取TPGY培养液1.4mL至无菌离心管中,14000g 离心2min,弃上清,加

　　入1.0mLPBS 悬浮菌体,14000g 离心2 min,弃上清,用400μLPBS 重悬沉淀,加入

　　10mg/mL溶菌酶溶液100μL,摇匀,36℃±1℃ 恒温装置中放置15min,加入10mg/mL蛋

　　白酶K溶液10μL,摇匀,60 ℃±1℃恒温装置1h,在100 ℃恒温装置中放置10min后经

　　14000g 离心2min,上清液转移至无菌小离心管中,加入3mol/L乙酸钠溶液50μL和95%

　　乙醇1.0mL,摇匀,-80℃或-20℃放置30min,14000g 离心10min,弃去上清液,沉淀干

　　燥后溶于200μLTE缓冲液,作为DNA 模板使用。

　　注:根据实验室实际情况,也可采用商品化试剂盒制备DNA模板。

　　c) 核酸浓度测定(必要时):取5μLDNA 模板溶液,加超纯水稀释至1mL,用核酸蛋白分析仪或

　　紫外分光光度计分别检测260nm 和280nm 波段的吸光值A260和A280。按式(1)计算DNA

　　质量浓度。当质量浓度在0.34μg/mL~340μg/mL或A260/A280在1.7~1.9之间时,适宜于

　　PCR扩增。

　　C =A260 ×N ×50 …………………………(1)

　　式中:

　　C ———DNA 质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);

　　A260———260nm 处的吸光值;

　　N ———核酸稀释倍数。

　　d) PCR扩增:

　　1) 分别采用针对各型肉毒毒素编码基因设计的特异性引物(见表1)进行PCR扩增,包括A

　　型肉毒毒素(botulinumneurotoxinA,BoNT/A)、B型肉毒毒素(botulinumneurotoxin

　　B,BoNT/B)、E型肉毒毒素(botulinumneurotoxinE,BoNT/E)和F型肉毒毒素(botulinumneurotoxinF,

　　BoNT/F)共计四型肉毒毒素编码基因,每个PCR 反应管检测一种型

　　别的肉毒毒素编码基因。

　　表1 肉毒毒素编码基因PCR 检测的引物序列及其产物

　　肉毒毒素编

　　码基因型别

　　引物序列(5’-3’) 扩增长度/

　　bp

　　序列位置

　　A型

　　上游引物GTGATA CAACCAGAT GGTAGTTAT AG

　　下游引物AAAAAACAAGTCCCAATT ATT AACTTT 983 GenBank 号:CP046450.1

　　位置:1596654-1597636

　　B型

　　上游引物GAGATG TTTGTGAAT ATT ATG ATCCAG

　　下游引物GTTCAT GCATTA ATA TCAAGGCTGG 492 GenBank 号:CP014219.1

　　位置:927932-928423

　　E型

　　上游引物CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT

　　下游引物TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC 410 GenBank 号:CP010521.1

　　位置:1165510-1165919

　　F型

　　上游引物GCTTCATTA AAGAACGGAAGCAGTGCT

　　下游引物GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG 1137 GenBank 号:CP022400.1

　　位置:2177283-2178419

　　2) 反应体系配制见表2,反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行

　　相应调整。

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　　表2 肉毒毒素编码基因PCR 检测的反应体系

　　试剂终浓度加入体积/μL

　　10×PCR缓冲液1× 5.0

　　25mmol/L MgCl2 2.5mmol/L 5.0

　　10mmol/LdNTPs 0.2mmol/L 1.0

　　10μmol/L 正向引物0.5μmol/L 2.5

　　10μmol/L 反向引物0.5μmol/L 2.5

　　Taq DNA聚合酶0.05U/μL 0.5

　　DNA模板— 1.0

　　ddH2O — 32.5

　　总体积— 50.0

　　注:也能使用商品化试剂盒进行反应体系配制。

　　3) 反应程序:预变性95℃、5min;循环参数94℃、1min,60℃、1min,72℃、1min;循环数

　　40;后延伸72℃、10min。

　　4) PCR扩增体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用含有已知产肉毒毒素梭菌菌株

　　DNA或含肉毒毒素编码基因的质控品作阳性对照,非产肉毒毒素梭菌基因组DNA 作阴

　　性对照,无菌水作空白对照。

　　e) 凝胶电泳检测PCR扩增产物:用0.5×TBE或1×TAE缓冲液配制1.2%~1.5%的琼脂糖凝

　　胶,凝胶加热融化后冷却至60 ℃ 左右加入相应体积的核酸染料(溴化乙锭0.5μg/mL、

　　Goldview5μL/100mL或其他核酸染料)制备胶块,取10μLPCR扩增产物与2.0μL6×加样

　　缓冲液混合,点样,其中一孔加入DNA 分子质量标准。0.5×TBE 或1×TAE 电泳缓冲液,

　　10V/cm恒压电泳,根据溴麝香草酚蓝的移动位置确定电泳时间,用紫外检测仪或凝胶成像系

　　统观察和记录结果。PCR扩增产物也可采用毛细管电泳仪进行检测。

　　f) 结果判定:阴性对照和空白对照均未出现条带,阳性对照出现预期大小的扩增条带(表1),判

　　定本次PCR检测成立;待测样品出现预期大小的扩增条带,判定为PCR 结果阳性,根据表1

　　判定产肉毒毒素梭菌菌株型别,待测样品未出现预期大小的扩增条带,判定PCR结果为阴性。

　　注:PCR试验环境条件和过程控制参照GB/T27403的规定执行。

　　6.3.3.3 实时荧光PCR 鉴定

　　挑取6.3.3.2中肉毒毒素编码基因检测阳性的菌株进行实时荧光PCR鉴定:

　　a) DNA 模板制备:见6.3.3.2的b)部分。

　　b) PCR 反应体系:总反应体系体积为25μL,10 × PCR 缓冲液2.5μL、上/下游引物

　　(10μmol/L)各0.8μL、探针(10μmol/L)0.5μL、dNTPs(2.5μmol/L)3μL、Taq DNA 聚合

　　酶(5U/μL)0.5μL、DNA 模板1μL、灭菌去离子水补足至25μL。每个反应均应设置至少2个

　　平行。

　　注:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。也能选用含有PCR 缓冲液、

　　MgCl2、dNTP和Taq DNA聚合酶等成分基于Taqman探针的实时荧光PCR预混液。

　　c) PCR反应条件:95 ℃、10min(可根据不同厂家的聚合酶要求调整),1个循环;95 ℃、20s,

　　60℃、30s,72℃、30s(FAM 荧光采集),45个循环。

　　注:PCR反应参数能根据基因扩增仪型号进行适当调整。

　　d) 引物和探针序列见表3。

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　　GB4789.12—2025

　　表3 产肉毒毒素梭菌荧光PCR 检测引物和探针序列

　　菌种名称基因名称引物和探针序列(5’-3’) 序列位置

　　梭菌属16SrRNA

　　上游引物GCTCGTGTCGTGAGATGTT

　　下游引物CTCRYTAGAGTSCTCAACYWAA

　　探针FAM-AAY AAY AAG GGT TGC GCT CGT

　　TGC-BHQ1

　　GenBank号:MT279666.1

　　位置:1036-1123

　　肉毒梭菌hydA

　　上游引物GTGGYACTA CAAGTA TAG TAG ATC AT

　　下游引物GTTGTA TAA CACCAT GAAAMCCAT AG

　　探针FAM-TCGGACCTA AAGGAT GTGATT TAC

　　ACCA-BHQ1

　　GenBank号:CP046450.1

　　位置:3318645-3318779

　　丁酸梭菌hydA

　　上游引物ATGGGTTAGGCAAGCAGAAA

　　下游引物TCCTTCCACTGTAGGGTAATATG

　　探针FAM-CAC CAC AAC AAA TAT TTG GAG

　　CAGCAAGT-BHQ1

　　GenBank号:CP033249.1

　　位置:3318645-3318779

　　e) 对照设置:检测过程(包括DNA 提取)中,每个反应均应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。

　　其中阳性对照模板为扩增片段的阳性克隆分子DNA 或阳性菌株DNA,阴性对照模板为非梭

　　菌菌株DNA,空白对照模板为无菌水。

　　f) 结果判读:阳性对照出现典型扩增曲线,Ct值<30;阴性对照无典型扩增曲线或Ct值≥40;空

　　白对照无典型扩增曲线或Ct值≥40。否则,结果视为无效。

　　当待测菌株检测Ct值≥40时,判定检测结果为梭菌属或某种梭菌阴性;当待测菌株Ct值<30

　　时,可判定检测结果为梭菌属或某种梭菌阳性;当待测菌株Ct值为30≤Ct<40时,应重复试验,若重复

　　试验结果Ct值≥40则判定为梭菌属或某种梭菌阴性,否则,判定为梭菌属或某种梭菌阳性。

　　注:若肉毒毒素检测结果为阳性,实时荧光PCR鉴定结果为梭菌属阳性,肉毒梭菌和丁酸梭菌均为阴性,可进一步

　　检测菌株是否为其他某种产肉毒毒素梭菌。

　　6.3.3.4 菌株产毒试验

　　将6.3.3.2或6.3.3.3检出的可疑产肉毒毒素梭菌阳性菌株接种庖肉培养基或TPGYT 培养基,按

　　6.3.1.2条件厌氧培养5d,按6.2的方法进行肉毒毒素检验。毒素确证试验阳性者,判定为产肉毒毒素

　　梭菌。也可根据毒素定型试验结果判定梭菌型别。

　　注:根据PCR阳性菌株型别,可直接用相应型别的肉毒毒素诊断血清进行毒素确证试验。

　　7 结果与报告

　　7.1 肉毒毒素检验结果报告

　　根据6.2.3和6.2.4试验结果,报告样品中检出或未检出肉毒毒素。

　　根据6.2.6定型试验结果,报告样品中检出某型别肉毒毒素。

　　7.2 产肉毒毒素梭菌检验结果报告

　　根据6.3各项试验结果,报告样品中未检出或检出产某型肉毒毒素的某种梭菌。

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　　GB4789.12—2025

　　附 录 A

　　培养基和试剂

　　A.1 生理盐水

　　A.1.1 成分

　　NaCl 8.5g

　　蒸馏水 1000mL

　　A.1.2 制法

　　将NaCl加入至1000mL蒸馏水中,溶解分装后121℃高压灭菌15min。

　　A.2 庖肉培养基

　　A.2.1 成分

　　蛋白胨30.0g

　　牛肉浸粉3.0g

　　酵母浸粉5.0g

　　磷酸二氢钠5.0g

　　葡萄糖3.0g

　　可溶性淀粉2.0g

　　蒸馏水1000mL

　　碎肉渣适量

　　A.2.2 制法

　　将除碎肉渣外的各成分加入蒸馏水中,搅匀后加热溶解,备用。

　　在20mm×150mm 试管中先加入碎肉渣高1cm~2cm,每管加入还原铁粉0.1g~0.2g或少许

　　铁屑,再加入配制肉汤15mL,如厌氧装置较简易,且在有氧环境中操作时间较长,可向管内加入液体石

　　蜡覆盖培养基0.3cm~0.4cm,121℃高压灭菌15min,灭菌后的培养基在25℃的pH 为7.4±0.1。

　　A.3 胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤(TPGYT)培养基

　　A.3.1 基础成分(TPGY)

　　胰酪胨50.0g

　　蛋白胨5.0g

　　酵母浸粉20.0g

　　葡萄糖4.0g

　　硫乙醇酸钠1.0g

　　蒸馏水1000mL

　　A.3.2 胰蛋白酶溶液

　　称取胰蛋白酶(活力1∶250)1.5g,加入100 mL 蒸馏水中溶解,使用0.22μm 滤膜过滤除菌,

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　　2℃~8℃保存备用。

　　A.3.3 制法

　　将A.3.1中成分溶于蒸馏水中,分装20mm×150mm 试管,每管15mL,加入液体石蜡覆盖培养

　　基0.3cm~0.4cm,121℃高压灭菌10min,灭菌后的培养基在25℃的pH 为7.2±0.1。2℃~8℃冷

　　藏,两周内使用。临用接种样品时,每管加入胰蛋白酶溶液1.0mL。

　　A.4 卵黄琼脂培养基

　　A.4.1 基础培养基成分

　　酵母浸粉5.0g

　　胨20.0g

　　胰胨5.0g

　　氯化钠5.0g

　　琼脂20.0g

　　蒸馏水1000mL

　　A.4.2 卵黄乳液

　　用硬刷清洗鸡蛋2个~3个,沥干,杀菌消毒表面,无菌打开,取出内容物,弃去蛋白,用无菌注射器

　　吸取蛋黄,放入无菌容器中,加等量无菌生理盐水,充分混匀,2℃~8℃保存备用。

　　A.4.3 制法

　　将A.4.1中成分溶于蒸馏水中,分装,121 ℃高压灭菌15min,灭菌后的培养基在25 ℃的pH 为

　　7.0±0.2,冷却至50 ℃左右,按每100mL 基础培养基加入15 mL 卵黄乳液,充分混匀,倾注平板,

　　36℃±1℃培养24h进行无菌检查后,2℃~8℃保存备用。

　　A.5 哥伦比亚血琼脂培养基

　　A.5.1 基础培养基成分

　　胰酪胨10.0g

　　肉胃蛋白酶水解物5.0g

　　酵母浸粉5.0g

　　氯化钠5.0g

　　心胰酶消化物3.0g

　　淀粉1.0g

　　琼脂13.0~15.0g

　　A.5.2 无菌脱纤维羊血

　　无菌操作条件下,将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中,沿同一方向连续振摇约10min,静置后

　　除去附有血纤维的玻璃珠即可。

　　A.5.3 制法

　　将A.5.1中成分溶于1000mL蒸馏水中,分装,121℃高压灭菌15min,灭菌后的培养基在25 ℃

　　的pH 为7.3±0.2,冷却至45℃左右,加入5%无菌脱纤维羊血,充分混匀,倾注平板,备用。

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　　A.6 明胶磷酸盐缓冲液

　　A.6.1 成分

　　明胶2.0g

　　磷酸氢二钠(Na2HPO4) 4.0g

　　蒸馏水1000mL

　　A.6.2 制法

　　将A.6.1中成分溶于蒸馏水中,121℃高压灭菌15min,灭菌后在25℃的pH 为6.2。

　　A.7 磷酸盐缓冲液(PBS)

　　A.7.1 成分

　　氯化钠7.650g

　　磷酸氢二钠0.724g

　　磷酸二氢钾0.210g

　　蒸馏水1000mL

　　A.7.2 制法

　　将A.7.1中成分溶于蒸馏水中,121℃高压灭菌15min,灭菌后在25℃的pH 为7.4。

　　A.8 革兰氏染色液

　　A.8.1 结晶紫染色液

　　A.8.1.1 成分

　　结晶紫1.0g

　　95%乙醇20.0mL

　　1%草酸铵水溶液80.0mL

　　A.8.1.2 制法

　　将结晶紫完全溶于乙醇中,再与草酸铵水溶液混合。

　　A.8.2 革兰氏碘液

　　A.8.2.1 成分

　　碘1.0g

　　碘化钾2.0g

　　蒸馏水300mL

　　A.8.2.2 制法

　　将碘和碘化钾混合,加入少许蒸馏水充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。

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　　A.8.3 沙黄复染液

　　A.8.3.1 成分

　　沙黄0.25g

　　95%乙醇10.0mL

　　蒸馏水90mL

　　A.8.3.2 制法

　　将沙黄溶于乙醇中,再加蒸馏水至100mL。

　　A.8.4 染色方法

　　涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液覆盖,染色1min,水洗;滴加革兰氏碘液覆盖,作用

　　1min,水洗;滴加95%乙醇脱色15s~30s(可将乙醇覆盖整个涂片,立即倾去,再用乙醇覆盖涂片,作

　　用约10s,倾去脱色液,滴加乙醇从涂片流下至出现无色为止),水洗;滴加沙黄复染液覆盖,染色

　　1min,水洗,待干、镜检。

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