GB 31659.12-2025 食品安全国家标准 禽蛋和奶中氨基糖苷类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

　　1　范围

　　本文件规定了禽蛋和奶中大观霉素、双氢链霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、潮霉素B和

　　安普霉素等氨基糖苷类药物残留量检测的制样和液相色谱串联质谱测定方法.

　　本文件适用于禽蛋和牛奶、羊奶中大观霉素、双氢链霉素、链霉素、卡那霉素A、庆大霉素C1、庆大霉

　　素C1a、庆大霉素C2+C2a、新霉素B、潮霉素B和安普霉素等氨基糖苷类药物残留量的检测,其他类型奶

　　的检测可参照执行.

　　2　规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,

　　仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本

　　文件.

　　GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法

　　3　术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义.

　　4　原理

　　试样中残留的氨基糖苷类药物用三氯乙酸溶液提取,亲水亲脂固相萃取柱净化,液相色谱串联质谱

　　法测定,外标法定量.

　　5　试剂和材料

　　除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T6682规定的一级水.

　　5?1　试剂

　　5?1?1　甲醇(CH3OH):色谱纯.

　　5?1?2　乙腈(CH3CN):色谱纯.

　　5?1?3　甲酸(HCOOH):色谱纯.

　　5?1?4　异丙醇(C3H7OH):色谱纯.

　　5?1?5　乙酸铵(CH3COONH4):色谱纯.

　　5?1?6　三氯乙酸(Cl3CCOOH).

　　5?1?7　氨水(NH4OH).

　　5?2　溶液配制

　　5?2?1　5%三氯乙酸溶液:取三氯乙酸50g,用水溶解并稀释至1000mL.

　　5?2?2　5%甲醇溶液:取甲醇5mL,用水稀释至100mL.

　　5?2?3　0?1mol/L乙酸铵溶液:取乙酸铵0?77g,用水溶解并稀释至100mL.

　　5?2?4　0?002mol/L乙酸铵溶液:取0?1mol/L乙酸铵溶液10mL,用水稀释至500mL.

　　5?2?5　洗脱溶液:取甲酸20mL、异丙醇10mL、0?002mol/L乙酸铵溶液170mL,混匀,用甲酸调节pH

　　1

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　　至0?8.

　　5?2?6　流动相A:取甲酸5mL、0?1mol/L乙酸铵溶液10mL,用水稀释至500mL.

　　5?2?7　流动相B:取甲酸5mL、0?1mol/L乙酸铵溶液10mL,用乙腈稀释至500mL.

　　5?3　标准品

　　盐酸大观霉素、硫酸卡那霉素A 含量≥96?0%,硫酸双氢链霉素、硫酸链霉素、潮霉素B 含量≥

　　92?0%,庆大霉素C1五乙酸盐、庆大霉素C1a五乙酸盐、庆大霉素C2五乙酸盐含量≥95?0%,硫酸新霉

　　素B、硫酸安普霉素含量≥99?0%,具体见附录A.

　　5?4　标准溶液制备

　　5?4?1　标准储备液:取标准品各适量(相当于各活性成分约10mg),精密称定,用水适量使溶解并稀释定

　　容至10mL聚丙烯容量瓶,分别制成浓度均为1mg/mL的标准储备液.于聚丙烯圆形广口瓶中2℃~

　　8℃保存,有效期1个月.

　　5?4?2　混合标准中间液Ⅰ:准确移取双氢链霉素、链霉素、卡那霉素A、庆大霉素C1、庆大霉素C2+C2a、

　　潮霉素B和安普霉素标准储备液各0?1mL,大观霉素、庆大霉素C1a、新霉素B标准储备液各0?2mL,于

　　10mL聚丙烯容量瓶,用水稀释定容至刻度,配制成混合标准中间液.其中,双氢链霉素、链霉素、卡那霉

　　素A、庆大霉素C1、庆大霉素C2+C2a、潮霉素B和安普霉素浓度均为10μg/mL,大观霉素、庆大霉素

　　C1a、新霉素B浓度均为20μg/mL .于聚丙烯圆形广口瓶中2℃ ~8℃保存,有效期1周.

　　5?4?3　混合标准中间液Ⅱ:准确移取潮霉素(B)安普霉素标准储备液各0?1mL,大观霉素、双氢链霉素、

　　链霉素、卡那霉素(A)庆大霉素C1、庆大霉素C1a、庆大霉素C2+C2a、新霉素B标准储备液各0?4mL,于

　　10mL聚丙烯容量瓶,用水稀释至刻度,配制成混合标准中间液.其中,潮霉素(B)安普霉素浓度均为

　　10μg/mL,大观霉素、双氢链霉素、链霉素、卡那霉素(A)庆大霉素C1、庆大霉素C1a、庆大霉素C2+C2a、

　　新霉素B浓度均为40μg/mL.于聚丙烯圆形广口瓶中2℃~8℃保存,有效期1周.

　　5?4?4　混合标准工作液Ⅰ:准确移取混合标准中间液Ⅰ适量,用洗脱溶液稀释,配制成双氢链霉素、链霉

　　素、卡那霉素A、庆大霉素C1、庆大霉素C2+C2a、潮霉素B 和安普霉素浓度分别为0?125μg/mL、

　　0?25μg/mL、0?50μg/mL、0?75μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL,大观霉素、庆大霉素C1a、新霉素

　　B浓度分别为0?25μg/mL、0?50μg/mL、1μg/mL、1?5μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL的混合标

　　准工作液.临用现配.

　　5?4?5　混合标准工作液Ⅱ:准确移取混合标准中间液Ⅱ适量,用洗脱溶液稀释,配制成潮霉素B、安普霉

　　素浓度分别为0?125μg/mL、0?25μg/mL、0?50μg/mL、0?75μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL,大

　　观霉素、双氢链霉素、链霉素、卡那霉素A、庆大霉素C1、庆大霉素C1a、庆大霉素C2+C2a、新霉素B浓度

　　分别为0?5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、12μg/mL的混合标准工作液.临

　　用现配.

　　5?5　材料

　　5?5?1　亲水亲脂固相萃取柱:200mg/6mL,或相当者.

　　5?5?2　尼龙微孔滤膜:0?22μm.

　　6　仪器和设备

　　6?1　液相色谱串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI).

　　6?2　分析天平:感量0?00001g和0?01g.

　　6?3　涡旋混合器.

　　6?4　振荡混合器.

　　6?5　低温高速离心机:转速不低于10000r/min.

　　6?6　pH 计.

　　6?7　组织匀浆机.

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　　GB31659?12—2025

　　6?8　固相萃取装置.

　　6?9　聚丙烯容量瓶.

　　6?10　聚丙烯圆形广口瓶.

　　7　试样的制备与保存

　　7?1　试样的制备

　　取适量新鲜或冷藏的空白或供试禽蛋,去壳并均质.

　　取适量新鲜或解冻的空白或供试奶,混合均匀.

　　a)　取均质后的供试样品,作为供试试样;

　　b) 取均质后的空白样品,作为空白试样;

　　c) 取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试样.

　　7?2　试样的保存

　　-18℃以下保存.

　　8　测定步骤

　　8?1　提取

　　称取试料(5±0?05)g于50mL聚丙烯离心管,加5%三氯乙酸溶液20mL,涡旋混合1min,振荡提

　　取15min,4℃下10000r/min离心5min,收集上清液,用氨水调节pH 至7?5,备用.

　　8?2　净化

　　固相萃取柱依次用甲醇、水各5mL活化,取备用液过柱,依次用水、5%甲醇溶液各3mL淋洗,抽干.

　　用洗脱溶液2?0mL 进行洗脱,收集洗脱液,抽干,涡旋,尼龙微孔滤膜过滤,供液相色谱串联质谱仪

　　测定.

　　8?3　基质匹配标准曲线的制备

　　8?3?1　禽蛋基质匹配标准曲线的制备

　　取空白试料,按8?1与8?2中步骤处理得到空白基质溶液.准确移取混合标准工作液Ⅰ各100μL,

　　用空白基质溶液稀释至1mL,制成双氢链霉素、链霉素、卡那霉素A、庆大霉素C1、庆大霉素C2+C2a、潮

　　霉素B和安普霉素浓度分别为12?5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、

　　300ng/mL,大观霉素、庆大霉素C1a、新霉素B浓度分别为25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、

　　200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL的系列基质匹配标准溶液,供液相色谱串联质谱仪测定.以特征离

　　子质量色谱峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线.求回归方程和相关系数.

　　8?3?2　牛羊奶基质匹配标准曲线的制备

　　取空白试料,按8?1与8?2中步骤处理得到空白基质溶液.准确移取混合标准工作液Ⅱ各100μL,用空

　　白基质溶液稀释至1mL,制成潮霉素B、安普霉素浓度分别为12?5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、

　　100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL,大观霉素、双氢链霉素、链霉素、卡那霉素A、庆大霉素C1、庆大霉素

　　C1a、庆大霉素C2+C2a、新霉素B浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL、

　　800ng/mL、1200ng/mL的系列基质匹配标准溶液,供液相色谱串联质谱测定.以特征离子质量色谱峰面

　　积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线.求回归方程和相关系数.

　　8?4　测定

　　8?4?1　液相色谱参考条件

　　a)　色谱柱:酰胺基柱,100mm×2?1mm,1?7μm,或相当者;

　　b) 柱温:40℃;

　　c) 进样量:5μL;

　　d) 流速:0?3mL/min;

　　e) 流动相:A 为甲酸乙酸铵溶液,B为甲酸乙酸铵乙腈溶液,梯度洗脱程序见表1.

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　　GB31659?12—2025

　　表1　梯度洗脱程序

　　时间

　　min

　　A

　　%

　　B

　　%

　　0?0 20 80

　　2?5 20 80

　　3?5 65 35

　　5?5 90 10

　　6?7 90 10

　　7?5 20 80

　　12?0 20 80

　　8?4?2　质谱参考条件

　　a)　离子源:电喷雾离子源;

　　b) 扫描方式:正离子扫描;

　　c) 检测方式:多反应监测;

　　d) 喷雾电压:5500V;

　　e) 雾化温度:550℃;

　　f) 气帘气:206?84kPa(30psi);

　　g) 雾化气:448?16kPa(65psi);

　　h) 待测药物的定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量见表2.

　　表2　定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量

　　化合物

　　定性离子对

　　m/z

　　定量离子对

　　m/z

　　去簇电压

　　V

　　碰撞能量

　　eV

　　大观霉素333?1>98?2

　　333?1>140?1 333?1>98?2 155 33?0

　　31?0

　　双氢链霉素584?4>263?1

　　584?4>246?2 584?4>263?1 244 40?0

　　57?0

　　链霉素582?4>263?2

　　582?4>221?4 582?4>263?2 270 44?3

　　49?0

　　卡那霉素A 485?2>163?2

　　485?2>324?3 485?2>163?2 50 33?0

　　24?3

　　庆大霉素C1 478?4>157?2

　　478?4>322?2 478?4>157?2 85 20?8

　　27?0

　　庆大霉素C1a 450?8>322?3

　　450?8>160?0 450?8>322?3 85 20?0

　　35?0

　　庆大霉素C2+C2a 464?0>160?3

　　464?0>322?0 464?0>160?3 61 31?0

　　19?0

　　新霉素B 615?4>161?3

　　615?4>293?2 615?4>161?3 90 38?0

　　34?9

　　潮霉素B 528?3>177?1

　　528?3>351?9 528?3>177?1 30 39?2

　　33?6

　　安普霉素540?3>378?3

　　540?3>217?0 540?3>378?3 108 25?0

　　36?0

　　8?5　测定法

　　8?5?1　定性测定

　　在相同测试条件下,试料溶液中氨基糖苷类药物色谱峰的保留时间与基质配备标准溶液中氨基糖苷

　　类药物色谱峰的保留时间偏差在±0?1min以内;且检测到的相对离子丰度应与浓度相当的基质匹配标

　　准溶液相对离子丰度一致,其允许偏差为±40%.

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　　GB31659?12—2025

　　8?5?2　定量测定

　　取试料溶液和相应的基质配备标准溶液,做单点或多点校准,按外标法以特征离子质量色谱峰面积定

　　量,基质配备标准溶液及试料溶液中的氨基糖苷类药物响应值均应在仪器检测的线性范围内.在上述色

　　谱质谱条件下,氨基糖苷类药物基质匹配标准溶液特征离子质量色谱图见附录B.

　　8?6　空白试验

　　取空白试样,除不加标准溶液外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作.

　　9　结果计算和表述

　　试样中氨基糖苷类药物的残留量按标准曲线或公式(1)计算.

　　X =

　　Cs×A As×m×V×1×0100000 ??????????????? (1)

　　式中:

　　X ———试样中氨基糖苷类药物残留量的数值,单位为微克每千克(μg/kg);

　　Cs ———基质匹配标准溶液中氨基糖苷类药物浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL);

　　A ———试料溶液中氨基糖苷类药物的色谱峰面积;

　　V ———洗脱溶液体积的数值,单位为毫升(mL);

　　As ———基质匹配标准溶液中氨基糖苷类药物的色谱峰面积;

　　m ———试料质量的数值,单位为克(g);

　　1000———换算系数.

　　10　方法灵敏度、正确度和精密度

　　10?1　灵敏度

　　本方法在禽蛋中双氢链霉素、链霉素、卡那霉素A、庆大霉素C1、庆大霉素C2+C2a、潮霉素B、安

　　普霉素的检出限均为5μg/kg,定量限均为10μg/kg;大观霉素、庆大霉素C1a、新霉素B的检出限均为

　　10μg/kg,定量限为20μg/kg.在牛羊奶中潮霉素B、安普霉素的检出限均为5μg/kg,定量限均为

　　10μg/kg;大观霉素、双氢链霉素、链霉素、卡那霉素A、庆大霉素C1、庆大霉素C1a、庆大霉素C2+

　　C2a、新霉素B的检出限均为20μg/kg,定量限为40μg/kg.

　　10?2　正确度

　　本方法禽蛋在10μg/kg~4000μg/kg、牛羊奶在10μg/kg~3000μg/kg添加浓度水平上的回收率

　　为60%~110%.

　　10?3　精密度

　　本方法的批内相对标准偏差≤15%,批间相对标准偏差≤20%.

　　5

　　GB31659?12—2025

　　附　录　A

　　(资料性)

　　氨基糖苷类药物中英文名称、化学分子式和CAS号

　　氨基糖苷类药物中英文名称、化学分子式和CAS号见表A?1.

　　表A?1　氨基糖苷类药物中英文名称、化学分子式和CAS号

　　中文名称英文名称化学分子式CAS号

　　盐酸大观霉素Spectinomycindihydrochloride C14H24N2O7?2HCL 21736G83G4

　　硫酸双氢链霉素Dihydrostreptomycinsesquisulfate C21H41N7O12?3/2H2SO4 5490G27G7

　　硫酸链霉素Streptomycinsulfate C21H39N7O12?3/2H2SO4 3810G74G0

　　硫酸卡那霉素A Kanamycinsulfate C18H36N4O11?H2SO4 25389G94G0

　　庆大霉素C1五乙酸盐GentamicinC1PentaacetateSalt C21H43N5O7?5CH3CO2H 25876G10G2

　　庆大霉素C1a五乙酸盐GentamicinC1aPentaacetateSalt C19H39N5O7?5CH3CO2H 26098G04G4

　　庆大霉素C2五乙酸盐(含C2、C2a) GentamicinC2PentaacetateSalt C20H41N5O7?5CH3CO2H 287916G51G2

　　硫酸新霉素B NeomycinBsulfate C23H46N6O13?3H2SO4 4146G30G9

　　潮霉素B HygromycinB C20H37N3O13 31282G04G9

　　硫酸安普霉素Apramycinsulfate C21H41N5O11?H2SO4 65710G07G8

　　6

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　　附　录　B

　　(资料性)

　　氨基糖苷类药物基质匹配标准溶液特征离子质量色谱图

　　氨基糖苷类药物基质匹配标准溶液特征离子质量色谱图见图B?1.

　　标引序号说明:

　　1———庆大霉素C1a特征离子质量色谱图(450?8>322?3);

　　2———庆大霉素C1特征离子质量色谱图(478?4>157?2);

　　3———庆大霉素C2+C2a特征离子质量色谱图(464?0>160?3);

　　4———新霉素B特征离子质量色谱图(615?4>161?3);

　　5———大观霉素特征离子质量色谱图(333?1>98?2);

　　6———卡那霉素A特征离子质量色谱图(485?2>163?2);

　　7———潮霉素B特征离子质量色谱图(528?3>177?1);

　　8———安普霉素特征离子质量色谱图(540?3>378?3);

　　9———链霉素特征离子质量色谱图(582?4>263?2);

　　10———双氢链霉素特征离子质量色谱图(584?4>263?1).

　　:、、(A)C1、C2+C2a、(B)25ng/mL,7

　　GB31659?12—2025

　　8

　　GB31659?12—2025

　　图B?1 (续)