NY/T 4477-2025 小豆品种鉴定SSR分子标记法

前　　言
本文件按照GB/T１?１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起
草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本文件由农业农村部种业管理司提出.
本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口.
本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、湖南农业大学、山西农业大学(山西省农业科学院)玉米
研究所、中国农业科学院作物科学研究所.
本文件主要起草人:邓超、颜军、焦雄飞、陈红霖、杨旭红、韩瑞玺、马莹雪、张凯淅、李嫒嫒、冯艳芳、雷
东阳、唐浩、陈红、张秀杰.
Ⅱ
NY/T４４７７—２０２５
小豆品种鉴定　SSR 分子标记法
１　范围
本文件规定了利用简单重复序列(SSR)标记进行小豆[Vignaangularis (Willd)Ohwi& Ohashi]品
种鉴定的操作程序、数据处理和结果判定.
本文件适用于小豆品种SSR指纹数据采集、数据库构建和品种鉴定.
２　规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,
仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文
件.
GB/T３５４３?２农作物种子检验规程扦样
GB/T６６８２分析实验室用水规格和试验方法
NY/T２５９４植物品种鉴定　DNA 分子标记法总则
３　术语和定义
NY/T２５９４规定的术语和定义适用于本文件.
４　缩略语
下列缩略语适用于本文件.
APS:过硫酸铵(ammoniumpersulphate)
bp:碱基对(basepair)
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyＧribonucleosidetriphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)
PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)
PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)
SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat)
Taq 酶:耐热DNA 聚合酶(TaqＧDNApolymerase)
Tris:三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM)
TE:三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(TrisＧEDTA)
TBE:三羟甲基氨基甲烷硼酸盐乙二胺四乙酸(TrisＧborateＧEDTA)
TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N′,N′Ｇtetramethylethylenediamine)
５　原理
不同小豆品种基因组中SSR的重复次数存在差异,这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测,
进而区分不同的小豆品种.
６　主要仪器设备及试剂
主要仪器设备及试剂见附录A.
１
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７　溶液配制
溶液配制方法见附录B.
８　引物相关信息
引物名单及序列见附录C,引物相关信息见附录D.
９　参照品种
参照品种相关信息见附录E.
１０　操作程序
１０?１　
样品准备
送检样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官.样品需扦样时,应符合GB/T３５４３?２的要求.每份样
品取不少于３０个个体的叶片或其他等效物,混合分析,必要时进行个体检测.
１０?２　DNA 提取
取幼苗或叶片２００mg~３００mg,置于２?０mL离心管,加液氮充分研磨;每管加入６００μL经６５℃预
热的CTAB提取液,充分混合,６５℃水浴４５min~６０min,其间多次轻缓颠倒混匀.每管加入与CTAB
提取液等体积的三氯甲烷和异戊醇混合液,轻缓混匀后静置１０min,１２０００r/min离心１０min.吸取上
清液转移至新的离心管中,加入等体积预冷的异丙醇,轻轻颠倒混匀,－２０℃放置３０min,４℃、１２０００r/
min离心１０min.弃上清液,用体积分数为７０％的乙醇溶液洗涤２遍,晾干,加入１００μL双蒸水或TE缓
冲液充分溶解,检测DNA 浓度后４℃备用.
注１:以上为推荐的DNA提取方法,DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用.DNA溶液的紫
外吸光度OD２６０与OD２８０的比值宜介于１?７~２?０.
注２:三氯甲烷和异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为２４∶１.
１０?３　PCR 扩增
１０?３?１　反应体系
PCR扩增反应体系的总体积和各组分的终浓度参照表１配制,可以依据试验条件调整.表１中的缓
冲液若含有氯化镁(MgCl２),不再加MgCl２溶液,加等体积双蒸水替代.利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(PAGE)检测时选择普通引物;利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物,荧光标记位于上游引物５′
端,推荐的荧光标记见附录D.
表１　PCR扩增反应体系
反应组分原浓度终浓度推荐体积,μL
１０×缓冲液(含MgCl２) １０× １× ２?０
dNTPs １０mmol/L ０?１mmol/L ０?２
Taq 酶５U/μL ０?０５U/μL ０?２
上游引物１０μmol/L ０?２mmol/L ０?４
下游引物１０μmol/L ０?２mmol/L ０?４
DNA ２５ng/μL ２?５ng/μL ２?０
双蒸水— — １４?８
总体积２０?０
２
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１０?３?２　反应程序
推荐反应程序为:９４℃预变性５min;９４℃变性３０s,５６℃退火３０s,７２℃延伸３０s,共３３个循环;７２
℃延伸５min,产物４℃保存.反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而做适当
的调整.
１０?４　PCR 产物检测
１０?４?１　变性PAGE
１０?４?１?１　制胶
用洗涤剂将玻璃板清洗干净,再用双蒸水、无水乙醇分别擦洗２遍.玻璃板干燥后,将０?５mL亲和
硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上,将０?５mL剥离硅烷工作液均匀涂在带凹槽的短玻璃板上.操作过程
中防止２块玻璃板互相污染.玻璃板彻底干燥后,将０?４mm 厚的塑料隔条整齐放在长玻璃板两侧,盖上
凹槽短玻璃板,用夹子固定,用水平仪检查玻璃胶室是否水平.取１００mL质量分数为６％的PAGE胶溶
液,加入５０μL四甲基乙二胺(TEMED)和５００μL质量分数为１０％的过硫酸铵(APS),迅速混匀,将胶灌
入玻璃胶室,灌胶过程中防止出现气泡.待胶室灌满后,在凹槽处将０?４mm 厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻
轻插入胶液约４mm.室温聚合１h以上.胶聚合后,清理胶板表面溢出的胶液,轻轻拔出梳子,用水清洗
干净备用.
注:为保证检测结果的准确性,建议玻璃板的规格为４５cm×３５cm.
１０?４?１?２　变性
在２０μLPCR产物(见１０?３?２)中加入４μL６×加样缓冲液,混匀.在PCR仪上运行９５℃变性５min,
取出立即置于冰上,冷却１０min以上备用.
１０?４?１?３　电泳
将胶板安装于电泳槽上,在电泳正极槽(下槽)加入６００mL的１×TBE缓冲液,负极槽(上槽)加入
６００mL１×TBE缓冲液,使其超过凝胶顶部约３cm.１８００V 恒压预电泳１０min~２０min.用移液器吹
吸加样槽,清除气泡和杂质.将样品梳(鲨鱼齿朝下)插入凝胶１mm~２mm.每一个加样孔点入３μL~
５μL样品.除送检样品外,还应同时加入参照品种扩增产物.１８００V 恒压电泳,电泳时间参考二甲苯青
指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围(见附录D)加以确定.二甲苯青指示带在质量分数为
６％PAGE胶电泳的移动位置与２３０bp扩增产物泳动的位置大致相当.扩增产物片段大小在(１００±３０)
bp、(１５０±３０)bp、(２００±３０)bp、(２５０±３０)bp范围的,电泳参考时间分别为１?５h、２?０h、２?５h、３?５h.
电泳结束后关闭电源,取下玻璃板并轻轻撬开,通常凝胶附着在长玻璃板上.
１０?４?１?４　染色
将附着凝胶的长玻璃板胶面向上浸入固定液中,轻轻晃动３min后取出,在双蒸水中快速漂洗,时间
不超过１０s;将胶板放入染色液中,轻轻晃动５min后取出,在双蒸水中快速漂洗,时间不超过１０s;将胶
板放入显影液中,轻摇晃动待条带清晰后取出,再迅速放入固定液中定影５min取出,在双蒸水中漂洗１min;
取出胶板,晾干,放在胶片观察灯上观察,记录结果,拍照保存.
注:固定液、染色液、双蒸水和显影液的用量,可依据胶板数量和大小调整,以淹没胶面为准.
１０?４?２　荧光毛细管电泳
１０?４?２?１　PCR产物样品准备
按照预先确定的引物分组,分别取等体积的同一组中不同荧光引物的扩增产物,混匀稀释.从混合液
中吸取１μL,加入DNA 分析仪专用９６孔板中.板中各孔分别加入０?１μL分子量内标和８?９μL去离子
甲酰胺,在PCR仪上９５℃变性５min,取出后立即置于冰上,冷却１０min以上,瞬时离心１０s后备用.
注:引物分组和稀释倍数通过荧光毛细管电泳预实验确定.
１０?４?２?２　等位变异检测
打开DNA 分析仪,检查仪器工作状态和试剂状态.将装有样品的９６孔上样板放置于样品架基座
上,打开数据收集软件,按照仪器使用手册,编辑样品表,执行运行程序,DNA 分析仪将自动运行,并保存
３
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电泳原始数据.
１０?５
数据分析
１０?５?１　数据读取
每个SSR位点的等位变异参照扩增片段大小命名,见附录D.对于变性PAGE,将送检样品在某一
位点扩增片段的迁移位置与对应的参照品种进行比较,确定送检样品在该位点的等位变异.对于荧光毛
细管电泳,通过参照品种消除不同批次间或者不同型号DNA 分析仪间可能存在的系统误差,使用片段分
析软件读取送检样品在该位点的等位变异.
纯合位点的等位变异数据记为X/X,杂合位点的等位变异数据记录为X/Y,其中X、Y 分别为该位点
上的２个等位变异,小片段数据在前,大片段数据在后.缺失位点的等位变异数据记录为０/０.
示例１:样品在某个位点上仅出现１个等位变异,为１６０bp,则该位点的等位变异数据记录为１６０/１６０.
示例２:样品在某个位点上有２个等位变异,分别为１６０bp、１６５bp,则该位点的等位变异数据记录为１６０/１６５.
１０?５?２　数据比对
将送检样品每个位点的等位变异数据逐一比对,按照位点相同、差异、数据缺失、无法判定等情形,记
录每个位点的结果.
１１　结果统计
统计比对结果为位点差异的情况,计算差异位点数.
１２　结果判定
１２?１
判定规则
当品种间差异位点数＞２,判定为“不同”;当品种间差异位点数≤２,判定为“疑同”;当品种间差异位点
数≤２,但存在位点数据缺失或无法判定情形时,不做判定.
１２?２
结果表述
送检样品与对照样品(或数据库中品种)采用检测平
台,检测位点数为,差异位点数为,判定为.当存在位点数据缺失或无
法判定情形时,应表述具体情况.
示例１:送检样品A与对照样品B采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测平台,检测位点数为２８,差异位点数为２,判定为
疑同.
示例２:送检样品A与对照样品B采用荧光毛细管电泳检测平台,检测位点数为２８,差异位点数为１,送检样品在X２６
位点数据缺失.
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附　录　A
(规范性)
主要仪器设备及试剂
　
A?１　主要仪器设备
A?１?１　PCR扩增仪.
A?１?２　高压电泳仪:最高电压不低于２０００V,具有恒电压、恒电流和恒功率功能.
A?１?３　垂直电泳槽及配套的制胶附件.
A?１?４　离心机.
A?１?５　水平摇床.
A?１?６　胶片观察灯.
A?１?７　电子天平:感量为０?１g和０?０１g.
A?１?８　微量移液器:规格分别为１０μL、２０μL、１００μL、２００μL、１０００μL,连续可调.
A?１?９　磁力搅拌器.
A?１?１０　核酸浓度测定仪或超微量紫外分光光度计.
A?１?１１　微波炉.
A?１?１２　高压灭菌锅.
A?１?１３　酸度计.
A?１?１４　水浴锅.
A?１?１５　低温冰箱.
A?１?１６　制冰机.
A?１?１７　凝胶成像系统或紫外透射仪.
A?１?１８　DNA 分析仪:基于毛细管电泳,有片段分析功能和数据分析软件,最低区分力１bp.
A?１?１９　其他相关仪器和设备.
A?２　主要试剂
除非另有说明,在分析中均使用分析纯试剂.
A?２?１　十六烷基三甲基溴化铵[CTAB,C１６H３３(CH３)３NBr,CAS号:５７Ｇ０９Ｇ０].
A?２?２　三氯甲烷(CHCl３,CAS号:６７Ｇ６６Ｇ３).
A?２?３　异戊醇(C５H１２O,CAS号:１２３Ｇ５１Ｇ３).
A?２?４　异丙醇[(CH３)２CHOH,CAS号:６７Ｇ６３Ｇ０].
A?２?５　乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa,C１０H１４N２Na２O８,CAS号:１３９Ｇ３３Ｇ３).
A?２?６　三羟甲基氨基甲烷(Tris,C４H１１NO３,CAS号:７７Ｇ８６Ｇ１).
A?２?７　浓盐酸(HCl,CAS号:７６４７Ｇ０１Ｇ０).
A?２?８　氢氧化钠(NaOH,CAS号:１３１０Ｇ７３Ｇ２).
A?２?９　１０×PCR缓冲液:含Mg２＋２５mmol/L.
A?２?１０　４种脱氧核糖核苷酸:dATP、dTTP、dGTP、dCTP.
A?２?１１　氯化钠(NaCl,CAS号:７６４７Ｇ１４Ｇ５).
５
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A?２?１２　Taq DNA 聚合酶(Taq 酶,CAS号:９０１２Ｇ９０Ｇ２).
A?２?１３　DNA Marker:DNA 片段分布范围在５０bp~５００bp.
A?２?１４　甲酰胺(CH３NO,CAS号:７５Ｇ１２Ｇ７).
A?２?１５　溴酚蓝(C１９H１０Br４O５S,CAS号:１１５Ｇ３９Ｇ９).
A?２?１６　二甲苯青(C２５H２７N２NaO６S２,CAS号:２６５０Ｇ１７Ｇ１).
A?２?１７　甲叉双丙烯酰胺[(H２C＝CHCONH)２CH２,CAS号:１１０Ｇ２６Ｇ９].
A?２?１８　丙烯酰胺(C３H５NO,CAS号:７９Ｇ０６Ｇ１).
A?２?１９　硼酸(H３BO３,CAS号:１００４３Ｇ３５Ｇ３).
A?２?２０　尿素(CH４N２O,CAS号:５７Ｇ１３Ｇ６).
A?２?２１　亲和硅烷.
A?２?２２　剥离硅烷.
A?２?２３　无水乙醇(C２H６O,CAS号:６４Ｇ１７Ｇ５).
A?２?２４　四甲基乙二胺(TEMED,C６H１６N２,CAS号:１１０Ｇ１８Ｇ９).
A?２?２５　过硫酸铵[APS,(NH４)２S２O８,CAS号:７７２７Ｇ５４Ｇ０].
A?２?２６　冰醋酸(CH３COOH,CAS号:６４Ｇ１９Ｇ７).
A?２?２７　硝酸银(AgNO３,CAS号:７７６１Ｇ８８Ｇ８).
A?２?２８　甲醛(HCHO,CAS号:５０Ｇ００Ｇ０).
A?２?２９　DNA 分析仪用丙烯酰胺胶液.
A?２?３０　DNA 分析仪用分子量内标.
A?２?３１　DNA 分析仪用电泳缓冲液.
A?２?３２　DNA 分析仪用光谱校准基质.
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附　录　B
(规范性)
溶液配制
　
试剂配制用水需符合GB/T６６８２的要求.
B?１　DNA 提取溶液的配制
B?１?１　０?５mol/LEDTA 溶液
称取１８６?１gNa２EDTA?２H２O,溶于８００mL水中,充分搅拌溶解,加NaOH 调pH 至８?０,加水定
容至１０００mL,１２１℃高压灭菌２０min.
B?１?２　０?５mol/LHCl溶液
量取２５mL浓盐酸(质量分数为３６％ ~３８％),加水定容至５００mL.
B?１?３　１mol/LNaOH 溶液
称取４０?０gNaOH,溶于８００mL水中,充分搅拌溶解,加水定容至１０００mL.
B?１?４　１mol/LTrisＧHCl溶液
称取１２１?１gTris碱,溶于８００mL 水中,充分搅拌溶解,加HCl调pH 至８?０,加水定容至１０００
mL,１２１℃高压灭菌２０min.
B?１?５　CTAB提取液
称取２０?０gCTAB、８１?７gNaCl置于１０００mL烧杯中,量取１００mL１mol/LTrisＧHCl溶液和４０mL
０?５mol/LEDTA 溶液倒入烧杯中,加７００mL水,充分搅拌溶解,加水定容至１０００mL,１２１℃高压灭菌
２０min.
B?１?６　TE缓冲液
量取５mL１mol/LTrisＧHCl溶液和１mL０?５mol/LEDTA 溶液,加水定容至５００mL,１２１℃高压
灭菌２０min,４℃保存.
B?２　PCR 扩增试剂的配制
B?２?１　dNTP溶液
分别配制dATP、dTTP、dCTP、dGTP终浓度为１００mmol/L的储存液.各取２０μL混合,加１２０μL
TE缓冲液定容,配制成每种脱氧核糖核苷酸终浓度为１０mmol/L的工作液,１２１ ℃高压灭菌２０min,
－２０℃保存.
B?２?２　SSR 引物溶液
开盖前瞬时离心１０s,按照说明书加TE缓冲液分别配制正向引物和反向引物终浓度为１００μmol/L
的储存液,取１０μL储存液,加９０μLTE缓冲液配制成终浓度１０μmol/L的工作液.
B?３　变性PAGE试剂的配制
B?３?１　质量分数为４０％的丙烯酰胺溶液
称取１９０?０g丙烯酰胺和１０?０g甲叉双丙烯酰胺,溶于４００mL水中,充分搅拌溶解,加水定容至
５００mL,置于棕色瓶中,４℃储存.
B?３?２　质量分数为６％的变性PAGE胶溶液
称取４２０?０g尿素置于１０００mL烧杯中,加入１００mL１０×TBE缓冲液和１５０mL质量分数为４０％
的丙烯酰胺溶液,定容至１０００mL.
７
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B?３?３　亲和硅烷缓冲液
分别量取９９?５mL无水乙醇和５００μL冰醋酸,加水定容至１００mL.
B?３?４　亲和硅烷工作液
分别量取１mL亲和硅烷缓冲液和５μL亲和硅烷原液,混匀.
B?３?５　剥离硅烷工作液
分别量取２５mL二甲基二氯硅烷和７５mL三氯甲烷,混匀.
B?３?６　质量分数为１０％的APS溶液
称取１?０gAPS,溶于１０mL水中,混匀,于４℃保存(不超过５d).
B?３?７　１０×TBE 缓冲液
称取Tris１０８?０g、硼酸５５?０g,溶于８００mL水中,加入３７mLEDTA 溶液(０?５mol/L,pH８?０),定
容至１０００mL.
B?３?８　１×TBE缓冲液
量取５０mL１０× TBE缓冲液,加水定容至５００mL,混匀.
B?３?９　６×加样缓冲液
分别称取０?２５g溴酚蓝和０?２５g二甲苯青,加入９８mL去离子甲酰胺和２mLEDTA 溶液(０?５mol/L,
pH８?０),搅拌溶解.
B?４　银染溶液的配制
B?４?１　固定液
量取１００mL冰醋酸,加水定容至１０００mL.
B?４?２　染色液
称取１?０g硝酸银,加水定容至１０００mL.
B?４?３　显影液
称取１０?０g氢氧化钠,溶于１０００mL水中,用前加２mL甲醛.
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附　录　C
(规范性)
引物名单及序列
　
引物名单及序列见表C?１.
表C?１　引物名单及序列
引物编号引物名称染色体上游引物序列(５′→３′) 下游引物序列(５′→３′)
XD１ X２６ １ GCCAAGGTGAACGGTGGTG GAGCGAGAATGGCGGAAGG
XD２ X２８ １ GCATACATAATGTGGTGAGATG GTCTCGTGCCTTTCACAC
XD３ X４１ ２ GCAGCAACGCACAGTTTCATGG GCAAAACTTTTCACCGGTACGACC
XD４ CEDG０１１ ４ CCCAACCAAAGCGTTTTG CTTCTAGACTCTGAGCACTG
XD５ E４８５２ ３ GCAGTTCTTCTCGTTCTTCTCTG AAAGTCCTCTAAAGCACAATCCC
XD６ XD６ ３ TGGTTGGTGGAAGATGCT CCTCTTTCGTCACGCTTT
XD７ E５０７Ｇ２９９ ４ CTGTTCTTGCTTCTGTAACCTGT GAACTGAGTTGGTTGCAGTAGGT
XD８ E４９７ ４ CCGAGAACTAAGTTTTGACATGG GTGCACATTCTTTTAGAAAACGG　
XD９ CEDG０２０ ５ TATCCATACCCAGCTCAAGG GCCATACCAAGAAAGAGG
XD１０ X９５ ５ GCTTGCATCACCCATGATTC AAGTGATACGGTCTGGTTCC
XD１１ X１０５ ５ CTTGAGAACCAACTCGAACTTC GGGAAATCGAAGAGGGACAG
XD１２ X１１３ ６ GAAGAAGAACCCTACCACAG CACCAAAAACGTTCCCTCAG
XD１３ X１１１ ６ GAAAAAGTAAGGCTGAGGAAGG CAAACCTCGTCATTCCACCATG
XD１４ L６２ ７ ACCTGCAAGTTGGCAAGA TATGTGCACGCATGGAAG
XD１５ X１２９ ７ GAGGGATCTCCAAAGTTCAACGG GAAGGCTCCGAAGTTGAAGGTTG
XD１６ CEDG０４１ ７ GCTGCATCTCTATTCTCTGG GCCAACTAGCCTAATCAG
XD１７ X１４９ ８ GTGTGAAACATGTAGCACGGTG GGTTCTCTCTCTCCCTCTC
XD１８ X１４７ ８ GTAGAACAGTTATGACACATG TGTTAACTTCGTTGGGTACAC
XD１９ CEDG０５６ ９ TTCCATCTATAGGGGAAGGGAG GCTATGATGGAAGAGGGCATGG
XD２０ L５２ ９ GAGGCCAATCCCATAACTTT AGCACCACATCAGAGATTCC
XD２１ CEDG０２１ １０ GCAGAATTTTAGCCACCGAG AAAGGATGOGAGAGTGTAGC
XD２２ X１８０ １０ GAAGGGAATGAAAATGAAACCC GTTCAATCCATTCAGTCTCC
XD２３ XD２３ １０ TTGAAGAGGTGGAAAGGATG ATAGTTCCCCAACGCCAT
XD２４ G１５５ １１ AGGTGAATGTGAATCGGAGC AATCCCACAAGATTTGCCAG
XD２５ CEDG０４８ １ TCTCTTCCTCTATGGCTTGG GCTCCTCTTTTTGCTGCATC
XD２６ X３ ６ CCCGATGAACGCTAATGCTG CGCCAAAGGAAACGCAGAAC
XD２７ X１ １ GTGCAGCCACTACATGAATG GAAGTTGACACTCATCCACC
XD２８ E５０５７Ｇ１８０ ５ AGTTCCGAAATTGGGTATTTGTT ACACCCACAATAACTATTCGCAG
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附　录　D
(资料性)
引物相关信息
　
引物相关信息见表D?１.
表D?１　引物相关信息
引物编号引物名称荧光标记等位变异范围,bp 主要等位变异,bp 参照品种
XD１ X２６ TAMRA １６９~２０１
１６９ 中红１５
１７１ 中农黑小豆１号
１７３ 龙小豆４号
１７７ 辽农红１０号
１７９ 保M９０８Ｇ１５
１８１ 苏０５８
１８３ 苏红１号
１８７ 渝红２号
１９７ 山西隰县小豆
２０１ 晋红小豆２号
XD２ X２８ HEX ２１４~２１８
２１４ 保M９０８Ｇ１５
２１６ 中农黑小豆１号
２１８ 苏红１号
XD３ X４１ ６ＧFAM １５０~１６１
１５０ 苏０５８
１５６ 中农黑小豆１号
１５９ 中红１５
１６１ 保M９０８Ｇ１５
XD４ CEDG０１１ ROX １５４~１７０
１５４ 山西隰县小豆
１５６ 渝红２号
１６０ 茶壳早生
１６２ 山西临县小豆
１６４ 苏红５号
１６６ 中农黑小豆１号
１６８ 辽农红１０号
１７０ 中红１５
XD５ E４８５２ ６ＧFAM １４２~１４９ １４２ 保M９０８Ｇ１５
１４９ 中农黑小豆１号
XD６ XD６ ６ＧFAM １９４~２０２
１９４ 辽红小豆２号
１９８ 渝红２号
２００ 保M９０８Ｇ１５
２０２ 中红１５
XD７ E５０７Ｇ２９９ ROX １５６~１６４
１５６ 保M９０８Ｇ１５
１５８ 中农黑小豆１号
１６０ ２０００１３
１６２ 龙小豆４号
１６４ 晋红小豆３号
XD８ E４９７ ６ＧFAM １４５~１５４
１４５ 保M９０８Ｇ１５
１５２ 龙小豆４号
１５４ 中农黑小豆１号
１０
NY/T４４７７—２０２５
表D?１　(续)
引物编号引物名称荧光标记等位变异范围,bp 主要等位变异,bp 参照品种
XD９ CEDG０２０ TAMRA １９３~２２３
１９３ 晋红小豆２号
１９５ 保M９０８Ｇ１５
２０７ 中红１６
２０９ 辽农红９号
２１１ 苏红１号
２１３ 辽农红１０号
２１５ 苏红５号
２１７ 中红１５
２１９ 山西隰县小豆
２２３ 白红１２号
XD１０ X９５ ６ＧFAM １３５~１４６
１３５ 中红１５
１３７ 苏红１号
１３９ 保M９０８Ｇ１５
１４１ 苏红５号
１４３ 苏红３号
１４６ 晋红小豆２号
XD１１ X１０５ HEX １９３~２０７
１９３ 苏红１号
１９９ 茶壳早生
２０１ 中农黑小豆１号
２０３ 中红１５
２０５ 保M９０８Ｇ１５
２０７ 京小７１
XD１２ X１１３ TAMRA １５０~１６２
１５０ 晋红小豆２号
１５２ 中农黑小豆１号
１５６ 苏红１号
１５８ 晋红小豆３号
１６０ 保M９０８Ｇ１５
１６２ 山西隰县小豆
XD１３ X１１１ ６ＧFAM １１１~１１７
１１１ 苏红３号
１１４ 保M９０８Ｇ１５
１１７ 山西隰县小豆
XD１４ L６２ HEX １４５~１４９
１４５ 保M９０８Ｇ１５
１４７ 苏红５号
１４９ 渝红２号
XD１５ X１２９ ROX ２２０~２３２
２２０ 苏红３号
２２２ 保M９０８Ｇ１５
２２４ 苏红１号
２２６ 中农黑小豆１号
２３０ 苏０５８
２３２ 苏红５号
XD１６ CEDG０４１ TAMRA １０３~１１８
１０３ 苏红３号
１１０ 晋红小豆２号
１１２ 苏０５８
１１４ 保M９０８Ｇ１５
１１６ 中农黑小豆１号
１１８ 龙小豆４号
１１
NY/T４４７７—２０２５
表D?１　(续)
引物编号引物名称荧光标记等位变异范围,bp 主要等位变异,bp 参照品种
XD１７ X１４９ ６ＧFAM ９６~１０８
９６ 中红１６
１００ 龙小豆４号
１０２ 保M９０８Ｇ１５
１０４ 吉红８号
１０６ 苏红１号
１０８ 茶壳早生
XD１８ X１４７ HEX １７２~１８８
１７２ 辽农红１０号
１７４ 苏０５８
１７８ 山西隰县小豆
１８０ 保M９０８Ｇ１５
１８２ 龙小豆４号
１８６ ２０００１３
１８８ 冀红０２１７
XD１９ CEDG０５６ HEX １７１~１７３ １７１ 中农黑小豆１号
１７３ 保M９０８Ｇ１５
XD２０ L５２ TAMRA １６１~１８７
１６１ 中红１６
１６７ ２０００１３
１７１ 苏红５号
１７３ 保M９０８Ｇ１５
１７５ 山西隰县小豆
１７７ 中农白小豆１号
１７９ 白红１２号
１８１ 山西临县小豆
１８３ 中农黑小豆１号
１８５ 晋红小豆３号
１８７ 品红２０１４Ｇ１６６
XD２１ CEDG０２１ ROX １５０~１７２
１５０ ２０００１３
１５２ 中红１６
１５６ 中农黑小豆１号
１５８ 河南汝阳黑小豆
１６０ 渝红２号
１６８ 晋红小豆３号
１７０ 苏红５号
１７２ 中红１５
XD２２ X１８０ HEX １６４~１８５
１６４ 中红１５
１７０ 晋红小豆３号
１７２ 保M９０８Ｇ１５
１７４ 中农黑小豆１号
１７６ 中红１６
１７８ ２０００１３
１８５ 苏红５号
XD２３ XD２３ ６ＧFAM １５６~１６２
１５６ 保M９０８Ｇ１５
１５９ 中农黑小豆１号
１６２ 山西临县小豆
XD２４ G１５５ HEX １１８~１２４
１１８ 保M９０８Ｇ１５
１２０ 苏红５号
１２４ 中红１５
１２
NY/T４４７７—２０２５
表D?１　(续)
引物编号引物名称荧光标记等位变异范围,bp 主要等位变异,bp 参照品种
XD２５ CEDG０４８ ６ＧFAM ２２０~２５９
２２０ 苏红５号
２２８ 山西隰县小豆
２３０ 辽农红１０号
２４１ 渝红２号
２４３ 保M９０８Ｇ１５
２４５ 苏红１号
２４７ 中红１５
２５１ 中农黑小豆１号
２５３ 山西临县小豆
２５９ 中红１６
XD２６ X３ ６ＧFAM １９５~２４７
１９５ ２０００１３
２０６ 吉红８号
２０８ 中红１６
２１０ 苏０５８
２１２ 龙小豆４号
２１４ 中红１６
２１６ 保M９０８Ｇ１５
２１８ 辽红小豆２号
２２０ 山西临县小豆
２２２ 中农黑小豆１号
２４７ 苏红１号
XD２７ X１ ROX １２４~１３２
１２４ 辽农红１０号
１２８ 晋红小豆３号
１３０ 山西隰县小豆
１３２ 中农黑小豆１号
XD２８ E５０５７Ｇ１８００ ROX １３８~１４４ １３８ 保M９０８Ｇ１５
１４４ 中农黑小豆１号
　　注１:附录D中采用的荧光标记仅为示例,采用其他荧光标记类型时,需要用参照品种校正数据.
　　注２:附录D中未包括的等位变异,应按本文件方法,确定其大小和相应参照品种.
　　注３:附录D中所列参照品种仅为示例,与参照品种具有相同等位变异的其他品种也可用作该等位变异的参照品种.
１３
NY/T４４７７—２０２５
附　录　E
(资料性)
参照品种相关信息
　
参照品种相关信息见表E?１.
表E?１　参照品种相关信息
编号品种名称品种来源保藏编号编号品种名称品种来源保藏编号
１ ２０００１３ 国家作物种质
库中期库B００４８０６ １４ 龙小豆４号
农业农村部植物
新品种保藏中心XIN３１７０９
２ 白红１２ 国家作物种质
库中期库— １５ 品红２０１４Ｇ１６６ 国家作物种质
库中期库—
３ 保M９０８Ｇ１５ 农业农村部植物
新品种保藏中心XIN２５９８５ １６ 山西临县小豆
农业农村部植物
新品种保藏中心XIN２８９７３
４ 茶壳早生
国家作物种质
库中期库B０００１６６２ １７ 山西隰县小豆
农业农村部植物
新品种保藏中心XIN２８９７８
５ 河南汝阳黑小豆
农业农村部植物
新品种保藏中心XIN２８９７６ １８ 苏０５８ 国家作物种质
库中期库—
６ 吉红８号
国家作物种质
库中期库— １９ 苏红１号
国家作物种质
库中期库—
７ 冀红０２１７ 农业农村部植物
新品种保藏中心XIN２４６９０ ２０ 苏红３号
农业农村部植物
新品种保藏中心XIN２８４９５
８ 晋红小豆２号
山西农业大学
(山西省农业科学院) — ２１ 苏红５号
农业农村部植物
新品种保藏中心XIN２８５４５
９ 晋红小豆３号
山西农业大学
(山西省农业科学院) — ２２ 渝红２号
江苏省农业
科学院—
１０ 京小７１ 国家作物种质
库中期库B０００００８０ ２３ 中红１５ 农业农村部植物
新品种保藏中心XIN３２５８８
１１ 辽红小豆２号
国家作物种质
库中期库B０００５２５７ ２４ 中红１６ 农业农村部植物
新品种保藏中心XIN３２５８７
１２ 辽农红１０号
农业农村部植物
新品种保藏中心XIN４００５０ ２５ 中农白小豆１号
农业农村部植物
新品种保藏中心XIN２８９７２
１３ 辽农红９号
农业农村部植物
新品种保藏中心XIN４００５１ ２６ 中农黑小豆１号
农业农村部植物
新品种保藏中心XIN２８９７５
１４